抗精子抗體是指男性或者女性,對男性精液有抵抗作用,使精子無法正常和卵子結合,導致不孕不育的發生。抗精子抗體是一個復雜的病理產物,男女均可罹患,其確切原因尚未完全明瞭。那麼,抗精子抗體怎麼檢查啊?
1、酶聯免疫吸附試驗
(1)精子抗原制備:篩選收集精液常規檢查正常的精液,用生理鹽水反復離心洗滌,盡可能除去精漿,經超聲波超聲粉碎,10~ 15min 高速離心,吸上清,測定上清液蛋白濃度,將蛋白濃度稀釋為 3.5~ 5.0μg/mL,為精子抗原溶液。
(2)反應板包被抗原:將人精子抗原稀釋成 3.5~ 5μg/mL,包被液加到聚氯乙烯微量測定板內,每孔 100μL,置 4℃ 冰箱過夜。
(3)封閉處理:次日早晨,傾去抗原溶液,用洗滌 PBS洗 3次,每次 5min,每次洗滌後都要將板在紙上拍幹,再加入 1% 的聚乙烯醇溶液 200μL封閉,置室溫 1h後同上法洗滌。
(4)加待測樣品:樣品用 PBS稀釋 100倍,每孔加入 100μL,同時加 As-Ab血清及正常處女血清作分別陽性和陰性對照,置 37℃ 溫育 1h,同上法洗滌。
(5)加酶結合物:HRP-Protein A 以 1∶640稀釋,每孔加入 100μL,置室溫 1h,同上洗滌。
(6)酶反應:加新鮮配制的 OPD 底物溶液,每孔加入 50μL,置室溫暗處 10min,再加10% H2SO4終止液每孔 50μL。
(7)結果判定:用酶標測定儀 490μm測其 OD 值,OD 值≥2.0時為陽性。
2、生物素-親和素酶聯免疫吸附試驗
(1)在 40孔微量測定板中加入 2~ 6μg/mL人精子膜抗原包被液,每孔 100μL,4℃ 過夜。加 1% 聚乙烯醇封板 37℃ 、30min,用洗液洗 3次。
(2)待檢血清 1∶1000稀釋(宮頸黏液 1∶100)每孔 100μL,37℃ 溫育 60min,同上洗滌。
(3)1∶100生物素化羊抗人 IgG,IgA 或 IgM,每孔 100μL,37℃ 、60min,同上洗滌。
(4)1∶100酶標親和素,每孔 100μL,22℃ 溫育 30min,同上洗滌。
(5)每孔加底物 100μL,37℃ 作用 5~ 10min,加 8mol/L H2SO450μL 終止反應。
(6)用酶標檢測儀測 A490光密度(OD)值,為雙份待測孔均值與雙份陰性孔均值之差,血清取 OD 值 0.20(宮頸黏液取 0.10)作為 AsAb陽性的判斷標準。